动物体内药品的遗留及对人类的影响

　　　喹诺酮类（quinolones，QNs）药物是近20年来迅速发展起来的一类十分重要的广谱抗菌药，被广泛应用于兽药临诊和水产养殖。由于QNs自身的潜在致癌性以及饲料中滥用和超量使用QNs导致致病菌产生耐药性，以及残留问题已引起广泛关注。欧盟FAOWHO食品添加剂联合**委员会（JECFA）对各种QNs已制定了**高残留限量（MRL），中国政府也根据实际情况制定了部分QNs的MRL.本文综述了2001年1月2006年9月国内外部分资料对QNs分析的前处理方法，以期为喹诺酮类药物的多残留研究提供参考。　　1国内外主要检测的样品和药物中国同**其他发达国家相比，由于科学技术以及检测仪器相对滞后造成检测QNs的动物及组织种类存在差异。国内外关于QNs的MRL主要是针对家禽、猪、牛等动物所制定。　　据文献显示，国外在2001年以前检测的样品主要是以鱼类为主，而2001年后以分析家禽、猪、牛等动物为主。而国内这方面的工作起步较晚，2003年才开始有这方面的报道，现今检测对象还是以鱼类为主（达到60以上），其次是家禽。近几年来分析较多的动物组织是肌肉组织，其次是肝、肾、皮肤、脂肪、牛奶和鸡蛋；关于饲料和液体组织的分析也有报道。　　自从环境毒理学研究的广泛开展，QNs在土壤中的检测方法也成为了当前研究的热点。　　现今药物分析的主流是两种或两种以上药物同时进行，主要包括了喹酸、氟钾喹、恩诺沙星、沙拉沙星和环丙沙星，其中都还不同程度涉及到http://www.ezhiyao.com/ 其它药物，如洛美沙星、达氟沙星、二氟沙星、麻保沙星、氧氟沙星等，而国内研究**多的是达氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、沙拉沙星等5种药物。　　2前处理方法21喹诺酮类药物的结构和性质在化学结构上，本类药物属吡酮酸衍生物（pyridonecarboxylic，PCAs），俗称？喹诺酮类。它们易溶于极性有机溶剂、冰醋酸、稀酸和稀碱溶液，在pH68的水中溶解度**小，在正己烷、甲苯和乙醚等有机溶剂中难溶或不溶。由于多数QNs在C3含有羧基，C7连接有哌嗪等含氮碱性基团，因此属于酸碱两性化合物，它们在中性溶液中主要以3种形式存在：阳离子、两性离子、阴离子，其酸解离常数pKa=5566，其碱解离常数pKa=7289，等电点pKI　7；少数不含哌嗪环的QNs在中性水溶液中仅以中性或阴离子存在，酸解离常数是pKa=6069.QNs的上述性质是设计提取、净化和分离方法的主要依据，但是根据QNs药物和样本的不同在设计方法时又存在着较大的差异，这也成为多残留分析工作的难点。　　22提取方法在药物分析中，一般依据相似相溶原理来设计提取方法。根据喹诺酮类药物溶解性的特点，生物样品中提取QNs的方法可以归纳为以下4种：（1）易溶于水的强有机溶剂如乙醇、丙酮、乙腈和甲醇等做为媒介把药物直接浸提出来；（2）在强有机溶剂中加入有机酸或无机酸如乙酸、三氯乙酸（TCA）等进行提取；（3）在强有机溶剂中加入碱性试剂如NaOH、NH3H2O等进行提取，或用缓冲液如磷酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液等直接浸提；（4）用不溶于水的有机溶剂如乙酸乙酯把样品和药物分开从而达到提取药物的目的。　　本文根据不同的提取溶剂，在不考虑净化方式的前提下，总结了国内外2000120066的部分分析QNs多残留的前处理方法。主要总结了易溶于水的有机溶剂直接提取多种药物，主要总结了在强有机溶剂中加酸浸提药物，而在强有机溶剂中加入碱性试剂和中性缓冲液提取药物总结。　　221易溶于水的有机溶剂直接提取在QNs多残留分析中，由于乙腈的溶解强度较大，粘度系数较低，能有效的脱蛋白、脱脂和释放结合态的药物，所以成为直接提取试剂的**，而用甲醇、丙酮直接提取QNs药物的文献几乎未见报道，可能是由于甲醇、丙酮和乙腈的提取效果虽然相似，但甲醇和丙酮提取液的杂质含量较高，所以很少使用。　　由于大部分的生物样品都含有一定的水分，在应用乙腈提取时一般要加入无水Na2SO4促进盐析，也有报道直接应用乙腈提取，但结果显示应用无水Na2SO4后，其回收率要高于乙腈直接浸提，出现上述现象的原因可能是样品盐析和脱水促进了有机溶剂浸提，但也有作者报道乙腈和水的等量混合对SAR具有显著的？潜溶效应，使溶解度增至4mgml.　　有机溶剂在直接浸提时，为提高提取溶液的渗透性和溶剂对样品的结合率，所分析的样品一般都需预先制作成肉糜状，取样量一般控制在110g，通常1g样品用510ml提取液，并且使用相同数量的溶剂，少量多次提取的效果比单次提取好。提取的方法主要是高速匀质（>10000rmin）12min或超声提取15min左右，从效果看两种方法无显著差异。　　222酸性有机溶剂提取向有机溶剂中加入无机酸或有机酸是QNs多残留分析中常用的提取方法，提取试剂一般是甲醇或乙腈中混入少量的HCl、三氯乙酸（TCA）、磷酸或柠檬酸，或者在乙醇和乙腈中加入乙酸。添加哪一种酸更有利于提取并没有化学依据，但施冰等在分析鱼肉等组织时曾做过乙腈冰乙酸（1001）和乙腈-01甲酸（80 ）的比较，认为乙腈-01甲酸（80 ）的回收率较好。影响提取效率的因素很多，除了有机溶剂中混入酸的种类之外还有有机溶剂与酸的比例以及浓度。以乙腈三氯乙酸（TCA）为例，POSYNIAK等曾研究不同比例乙腈TCA对鸡肉中ENR、CIP、DIF、SAR四种药物的提取效率，结果表明5TCA乙腈的比例为82或73时对各种QNs的回收率**高（80以上），91为**（低于75），结果还表明在TCA和乙腈的比例为82不变的前提下，TCA的浓度为10时具有**的回收率和脱蛋白效果。　　使用酸性有机溶剂分析样品时样品量一般取1g、5g或10g，所用提取溶剂的量随样品量的增加而增多，常用350ml进行两次提取，提取过程常用人工振荡和机械振荡，也有使用超声和匀浆的报道。HERMO等引进微波辅助提取（MAE）技术（溶剂40ml，微波力为40，时间4min）来提取药物，取得了与经典方法等同的效果，但该方法更**，简单，成本更低。　　223碱性或中性缓冲溶剂提取碱性提取剂一般是在亲水性有机溶剂如乙腈中加入NaOH或NH3H2O，而提取所用缓冲溶液一般是磷酸缓冲溶液，柠檬酸缓冲液也有报道。　　另据报道，提取溶剂与正己烷或正己烷乙醚同时加入，使得脱脂的过程与提取过程同时进行，从而提高了提取效率。　　SCHNEIDER在测定鸡蛋中CIP、NOR、DAN、ORB、SAR、DIF、ENR的残留时发现，用乙腈和NH3H2O重复提取蛋黄时，CIP的回收较低，加入适量的水可改善提取溶液的极性，有利于亲水性的CIP提取。使用碱性提取试剂分析药物时，碱性化合物的比例和缓冲溶液的pH是实验设计的重点，文献显示，通常控制pH49左右。　　人工震荡或机械振荡以及近年发展起来的超声提取是使用普遍的提取方法，样品分析量以0510g，提取溶剂的体积以150ml为宜。　　224与水互不相溶的有机溶剂浸提乙酸乙酯（EtAc）、氯仿，特别是二氯甲烷不但对人和环境的危害较大，而且具有对样品渗透性和释放药物能力差的特点，现在应用它们来做提取剂的报道越来越少。据相关资料显示2001年以来只有BAILAC等用二氯甲烷直接提取鸡肉中的CIP、SAR、DIF、ENR、DAN、OXO、FLU等8种药物，但是DAN的回收率不尽人意，只有62。笔者认为DAN和生物大分子结合较为紧密，不能被二氯甲烷充分提取可能是导致上诉结果的原因。现在也有研究人员用二氯甲烷进行二次提取，让匀浆的样品分离成缓冲溶液层和二氯甲烷层，从而提高了药物在水溶液中的溶解效率，从而达到有效去除杂质的目的。　　23净化方法样品虽然经过提取，但是由于样品基质非常复杂，往往存在少量的共萃取物，使用色谱法检测之前采取净化措施排除干扰是必要的。**常用的净化方法是液液萃取和固相萃取，也有使用分步液液萃取、液液萃取固相萃取联合、透析和超虑等净化方法的报道。适宜净化方法的选取主要依据样品的基质和先前使用的提取溶剂的性质来决定。　　液液萃取是**为基本的净化方法，但由于存在着操作费时（特别在多次萃取中）、需要消耗大量的高纯溶剂以及样品容易发生乳化等弊端，QNs药物分析时已不常使用，而主要应用在纯有机溶剂提取QNs以后的操作。现在QNs前处理方法（包括液液萃取）已经很少通过调节pH值把分析物从一个相转入另一个相，而是在一个稳定的pH下根据共萃取物溶解性的差异来净化样液，为提高QNs进入有机相的效率而常加入NaCl，通过盐析来降低萃取乳化达到促进有机溶剂萃取和有机相与水相分层。　　固相萃取（SPE）是QNs多残留分析中**常用的净化方法，几乎占到了QNs分析方法的70.根据QNs药物的化学性质，常用的SPE柱是硅胶键合C18或C8聚合物的反相SPE柱以及硅胶键合苯磺酸基或丙酸基等基团的阳离子交换SPE柱，阴离子交换SPE柱以及分子印迹聚合物填料的柱也有较少应用。VYNCHTA等为建立猪肾中QNs多残留的**检测方法，比较了各种反相或离子交换柱对NOR、OFL、ENR、MAR、ENO、CIP、DAN、CIN、FLU、OXO、NAL的净化效果，发现不但ISTSCX（阳离子交换柱）和SepPark（阴离子交换柱）对药物的回收率只有4075，而且萃取后样品杂质含量较多并且蒸发后的药物不溶解；而BEC（混合C18阳离子交换柱）和SDBRPS（混合C8阳离子交换柱）的回收率较好达到8398，但过BEC柱后的样液在检测时有微量的干扰物及出现较大基线波动。反相柱的吸附剂一般是非极性的，要求过柱样液使用酸性或中性溶液，过柱后淋洗液使用水、弱酸性水溶液或含有较低浓度有机溶剂的水溶液，常用的有机溶剂是甲醇、乙腈，洗脱液以含75以上甲醇的酸性或碱性溶液及纯甲醇较好。而离子交换柱淋洗液通常使用缓冲溶液，洗脱液常用含有大量有机溶剂的碱性溶液，如甲醇NH3H2O.　　样品净化后使用醋酸纤维或尼龙膜过滤提取液、净化液或进样液以便进一步纯化样液的报道较多。而LOLO等报道了二相透析来提取猪肝中的ENR、CIP，该实验应用可再生纤维透析管，使柠檬酸中的药物向二氯甲烷中透析，从而达到净化的目的。　　3结语可食用动物组织中QNs多残留分析是近10多年才发展起来的，由于样品的基质和分析物的不同，样品的前处理方法有所不同。现有文献报道的提取和净化方法不但费时、费力、浪费大量的试剂，而且提取和净化效果不甚理想。随着QNs的广泛使用，建立一种灵敏度高、省时、省工、省试剂并且切实行之有效的分析方法成为了当务之急。自动在线SPE，固相微萃取，自动序列渗析痕量富集系统（automatedsequentialtraceenrichmentofdialysatesASTED）将会成为今后样品前处理的发展方向。　　 来源:http://www.ezhiyao.com/ypnew_view.asp?id=1572