在食品检测中的使用与存在的问题

　　　在长期的农业生产中，农药的滥用和不合理使用，不仅造成了较严重的生态与环境问题，而且已使农药残留超标成为食品安全的突出问题。农药残留对人体的毒性作用除表现在影响生理活性酶的功能外，还对系统机能构成潜在的危害，甚至会降低机体的免疫功能，表现有“三致”（致癌、致畸、致突变）的作用。对于食品中农药残留的检测，除传统的GC、HPLC、MS、GC-MS/HPLC-MS等方法外，免疫学技术的应用也越来越深入，其中应用**广的是以固相载体吸附抗原/抗体为基础的酶联免疫分析法（ELISA）。该方法不像传统的色谱或质谱等方法那样需要复杂、昂贵的设备，操作简单，前处理简化，检测**、准确、灵敏，检验成本低，可同时进行大批量样品检测，因此具有广泛的实际应用价值。在美国，有关**机构，如环境保护署（EPA）、农业部食品安全检验司（FSIS-USDA）和化学会（AOAC）已制定了农药残留免疫学检验商品试剂盒评定和认可的建议准则，明确了测定结果的法律效力。　　1ELISA的原理ELISA的基本原理是将特异的抗原-抗体免疫学反应和酶学催化反应相结合，以酶促反应的放大作用来显示初级免疫反应。ELISA是通过在合适的载体上，酶标限定量抗原与未知抗原竞争固相抗体结合位点或固相抗原与未知抗原竞争限定量的标记抗体结合位点，形成抗体复合物。在一定底物参与下，复合物上的酶催化底物，使其水解、氧化或还原成另一种带色物质。由于酶的降解底物与显色是成正比的，通过肉眼观察或分光光度计测定，从而确定是否存在未知抗原或含量。　　2ELISA在农药残留检测中应用的技术要点2.1半抗原的设计与合成大多数农药是小分子物质（一般分子量小于1000），本身不具备刺激机体产生针对农药抗原决定簇的特异性，必须与大分子载体耦联后才能刺激机体产生抗体。因此，需要首先合成可直接与载体（一般为蛋白质）耦联，并能**程度模拟待测分子结构的半抗原。　　Frieia等认为一个理想的半抗原应包括待测物的特征结构、便于机体对特征结构进行识别的连接臂及其末端可与蛋白载体进行共价连接的功能基团。因此，半抗原设计的总体原则是：尽可能保留待测物特征结构，并在适当的位置引入合适的连接臂和功能基团，以便于下一步与大分子载体耦联。他们还强调连接臂的位置、长度、性质及末端的功能基团是半抗原合成的4个关键因素。连接臂的位置应结合分析目的来考虑。某些化合物结构中既存在某类化合物的公共特征，又有其各自的个性特征，如为了检测某一个化合物，则应突出其个性特征，制备化合物特异性抗体。如三嗪类的半抗原设计中，将阿特拉津（atrazine）和西玛津（simazine）分子中的4-或6-烷氨基取代的位置引入烷基羧酸连接臂，则可产生特异性抗体，而在-Cl用3-巯基丙酸取代后形成的半抗原，产生的是针对三嗪类化合物簇的特异性抗体。连接臂长度一般为3～6个碳，连接臂太短，载体的空间位阻影响免疫系统对半抗原特征结构的识别，且半抗原的立体结构容易受到载体局部化学环境的影响而发生变化；太长则可能因氢键、疏水作用或其他作用力使半抗原发生“折叠”。一般引入非极性连接臂，有时也可采用极性连接臂。功能基团可以在引入连接臂的时候带入，也可直接对待测物进行结构修饰而产生。常用的功能基团为-NH2和-COOH，-OH、-SH、-CO-等也可作为功能基团。　　对于所设计的目标半抗原化合物，总体来说其合成思路为对待测物进行结构修饰或利用相关的中间体、原料重新合成，具体来说有以下方法：（1）利用待测物现有结构，通过氧化、还原、取代、水解等反应产生相应的功能基团。（2）利用待测物相关的中间体来合成。（3）利用原料、试剂重新合成，在适当的位置引入带有功能基团的小分子。如贾明宏等　　利用三氯硫磷和甲醇为起始原料，通过4步反应在甲基对硫磷（parathion-methyl）的甲氧基部位引入了NH2（CH2）nCOOH的连接臂。（4）利用其代谢产物。如杀菌剂丁苯吗啉（fenpropimorph）的代谢产物丁苯吗啉酸（fenpropimorphicacid）可直接用于耦联。（5）从市场上搜寻与待测物结构极其类似且带有功能基团的化合物作为半抗原。　　2.2载体的选择由于蛋白质结构复杂、免疫原性好，不仅可以增加半抗原的分子量，而且可以利用其强免疫原性诱导免疫应答，对半抗原产生载体效应，故一般均选择各种蛋白质作为载体。常见的有牛血清白蛋白（BSA）、鸡蛋清蛋白（OVA）、钥孔血蓝蛋白（KLH）、兔血清白蛋白（RSA）、人血清白蛋白（HSA）等。由于BSA物化性质稳定、不易变性、价廉易得，而且其赖氨酸含量高，自由氨基多，在不同的pH值和离子强度下均有较大的溶解度，在含有有机溶剂（如吡啶等）的情况下均可和半抗原进行耦联，且在耦联后仍保持可溶状态，因此应用广泛。近年来，也有报道用人工合成多聚肽（常用多聚赖氨酸PLL）为载体，其优点是可增加半抗原的免疫原性。　　2.3人工抗原和酶标农药抗原的合成如果农药分子不具备连接反应基团，农药分子首先要经过衍生，之后通过连接物与载体蛋白连接。　　农药衍生不能导致半抗原分子结构发生明显改变，否则抗原性将发生变化。如果半抗原有反应功能团，则可根据具体情况用适当的双功能交联试剂与交联方法使半抗原与载体耦联。如对于羧基半抗原，常采用混合酸酐法、活泼酯法或碳二亚胺法；对于氨基半抗原，则多采用戊二醛法或重氮化；羟基半抗原则可直接与丁二酸酐衍生后再与蛋白质交联；巯基半抗原则可通过同源或异源双功能试剂交联；而酮基半抗原则常用氨基氧乙酸化。耦联反应不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行，并且耦联物浓度、缓冲溶液成分、离子强度、pH值以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等对耦联效果都有影响。　　半抗原结合比的高低与反应配比、反应基团的活性和位阻有关，半抗原结合比过高或过低均影响抗体的生成，一般以5～15为宜。但也有试验结果表明，半抗原结合比的大小对诱导抗体产生并无决定性的影响，每分子蛋白质只连接一个半抗原也可以产生特异性抗体，并且低结合比还有助于提高抗体的选择性和亲合力。　　另外，制备好的半抗原结合物在免疫动物前，要测定结合物中半抗原数目。因为结合中半抗原分子数目太多或太少，诱发抗体的能力都很差。用于合成农药-载体蛋白结合物的方法，在不引起酶失活情况下通常都可用来连接酶与农药，制备酶标农药抗原。　　2.4抗农药抗体的制备抗农药抗体可用农药-载体蛋白结合物直接免疫兔子等动物，之后每间隔1个月加强免疫1次，一般6个月左右可获得满意效价的抗血清。如果结合物免疫原性较差，则需要长达1年的免疫才能获得满意效价的抗血清。抗体的产生一般可采用两种途径：多克隆抗体和单克隆抗体技术。　　21411多克隆抗体是采用天然抗原免疫动物制备的血清，为多种抗体的混合物。多克隆抗体具有生产成本低、方法简便、来源广泛、易于制备等特点，但是其抗体的特异性不够强，会随着动物种类及个体差异而有变化，易发生交叉反应，而且生产数量也受限制，因此不利于生产大批量商品试剂盒。　　21412单克隆抗体由单一纯系细胞合成的抗体称为单克隆抗体，其重链、轻链、独特型完全相同，性质纯、效价高、特异性强，可以避免血清学上的交叉反应。单克隆抗体可通过用农药-载体蛋白结合物免疫小白鼠等，之后建立杂交瘤细胞系来生产。单克隆抗体虽然对设备要求相对较高，技术相对复杂，且成本也高，但其特性稳定，交叉反应少，并可大批量生产，在生产商品试剂盒上很有价值。　　3ELISA在食品农药残留检测中的应用ELISA用于食品农药残留检测，所需设备简单或者不需检测设备，样品前处理程序简化：液体食品，如牛奶、果汁、菜汁等通常不需前处理，可直接取样检测；固体食品，如谷物等经抽提剂抽提、浓缩并重新溶于水溶液中即可取样检测，可在几十分钟至几个小时内完成多批次样品检验（如用96孔微量酶标板法可同时完成44批次样品的检测），检验成本低，非常适合于现场应用。ELISA不仅可用来定性筛选，而且也可以用来定量分析，对很多农药的检测水平可达纳克（ng）甚至皮克（pg）水平。自20世纪80年代开始尝试把ELISA应用于食品农药残留检测以来，到目前国内外已有大量文献报道。检测的食品范围包括水果、蔬菜、饮料(http://www.cngzj.org/new_view.asp?id=57 中国饮料包装机械业的发展趋势)、啤酒、葡萄酒、鱼、肉、猪油、奶、植物油、蜂蜜、豆类、谷物及谷物加工产品等。国外有关食品中杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物（昆虫）生长调节剂等农药残留ELISA检测的一些文献报道。　　4ELISA在食品农药残留检测中存在的问题和应用前景ELISA检测系统中的抗农药抗体对于结构非相关的靶抗原（农药）表现极高的特异性，但某些与检测农药结构密切相关的农药，或待检农药的代谢产物可能与抗待检农药抗体发生不同程度的交叉反应。如果样品中存在这些物质，将导致定量检测准确度降低，使该农药的定量检测降为半定量或定性检测或者出现定性假阳性与假阴性，从而大大影响ELISA在食品农药残留检测中的可靠性和灵敏度。　　但从另一个角度看，这种交叉反应又是特别有用的，利用这种交叉反应，可用抗一种农药的抗体对包括母农药在内的结构密切相关的类似物及代谢产物进行多种农药残留的总量检测。另外，有研究者认为，可以把抗几种结构相关或非相关的农药抗体混合，利用这种混合抗体进行几种农药多残留分析，对于检测大批量且农药污染又没有规律的样品，可以节省大量的时间和工作量。由于食品的样本类型复杂，基质效应可能抑制免疫结合反应，不同品种农药性质各异，样本处理方法存在许多不确定性，同时抗体特异性和稳定性对检测结果影响机制尚不明确，影响其特异性和稳定性的因素还不是很清楚，从而使得ELISA在食品农药残留检测中的不确定因素增多且不易控制，难以实现标准化。这在一定程度上限制了ELISA在食品农药残留检测上的应用。　　要解决好上述问题，在以后要努力做到：（1）在设计合成农药半抗原的过程中要注重多学科知识的联合，并引入组合化学、计算机模拟、立体化学设计理念和生物活性高通量筛选技术，建立不同农药结构与活性关系的评价模型，进一步提高农药半抗原筛选效率和命中率；（2）应对ELISA对食品农药残留的结果和理化分析结果进行相关性试验评价，同时将ELISA对食品农药残留**定性筛选技术与色谱、质谱准确定量检测结合使用更为方便。　　总之，目前ELISA应用于食品农药残留免疫检测尚存在一定局限性，也不可能替代传统的色谱分析技术。但ELISA分析技术自身优势和在方法上的不断完善，尤其是随着亲和力强、特异性高的标准化抗体生产技术的突破和免疫传感器技术的日臻完善，ELISA检测技术会成为食品农药残留和食品安全质量控制的有效**检测手段。　　 来源:http://www.food71.com/ypnew_view.asp?id=2828