大豆蛋白的提炼及医疗价值

　　　近年来，从大豆乳清废水中提取生物活性物质的研究逐渐成为热点，其中较为成熟的是提取大豆低聚糖，对于大豆异黄酮和大豆皂甙的提取，也有相关专利，而对于大豆胰蛋白酶抑制剂的提取尚未受到充分重视。许多研究表明，豆类植物蛋白酶抑制剂具有多种生理功能，在生物农药及生物医药领域有着广泛的应用前景。胰蛋白酶抑制剂对热、酸环境相对稳定。目前仅在实验室水平上，采取水浸、酸提、盐析、离子交换层析或凝胶过滤层析等较为繁杂的方法纯化制得，且耗时长，产率和纯度也不高。用制备电泳的方法，虽可得到高纯度的胰蛋白酶抑制剂，但产率极低，花费更高。壳聚糖在自然界中含量丰富，安全无毒，容易进行化学修饰。壳聚糖微球树脂具有刚性大，亲水性好的特点，可以满足各种吸附与分离工作的需要。本文采用环氧氯丙烷作为活化剂，在壳聚糖微球树脂上引入环氧基，进而偶联胰蛋白酶，应用于大豆乳清液中胰蛋白酶抑制剂的分离纯化，初步探讨了固定化胰蛋白酶壳聚糖树脂作为一种新型亲和载体的可行性。　　1材料与方法1.1实验材料胰蛋白酶由上海化学试剂采购供应站分装厂提供；四甲基乙二胺、苯甲酰基精氨酸－β－萘基酰胺（BANA）为Sigma公司产品；脱乙酰度90％的壳聚糖为本实验室自制；其他试剂均为国产分析纯。　　1.2实验方法1.2.1交联壳聚糖树脂的制备及预处理壳聚糖树脂参照本实验室方法，采用反相悬浮交联法制备。　　1.2.2交联壳聚糖树脂的活化及与胰蛋白酶的偶联称取4.0g壳聚糖树脂于50mL的棕色瓶内，加入4mL不同浓度的NaOH的溶液，混合均匀，缓慢滴加不同量的环氧氯丙烷溶液。反应体系置于恒温水浴振荡器中，120r／min，设置不同温度，恒温振荡3h，活化树脂。将树脂转移到布氏漏斗上，用蒸馏水洗涤树脂至中性，然后用大量pH7.8的硼酸缓冲液冲洗，滤干即得活化的壳聚糖树脂。利用硫代硫酸钠与活化树脂上的环氧基加成反应测定环氧基的数量。称取4.0g活化后的湿树脂于50mL的带塞棕色三角瓶内，加入8.0mL含0.1g胰蛋白酶、pH7.8硼酸－硼砂缓冲液。反应体系置于恒温水浴振荡器中，80r／min，设置不同温度，恒温振荡偶联24h。布氏漏斗抽滤，另用10mL蒸馏水淋洗树脂，合并滤液，测定滤液中的蛋白质含量，并计算胰蛋白酶的偶联量。　　1.2.3活化环氧基含量的测定。　　1.2.4偶联量的测定。　　1.2.5胰蛋白酶活力的测定（BANA法）取0.04％的底物（BANA）溶液0.8mL与pH7.2的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液1　　1混合，加入不同量0.1％的胰蛋白酶水溶液（mL），充分混匀，37℃恒温水浴2h。取出立即置于冰水中，冷却5min，加入40％三氯乙酸溶液1.6mL，终止反应。　　8000r／min离心15min，取上清液1.0mL于Appendoff管中，加入1.0mL0.1％NaNO2溶液，静置3min后，加入1.0mL0.5％的（NH4）2SO4溶液，静置2min，加入2.0mL0.05％四甲基乙二胺95％乙醇溶液，混匀，于540nm处测定吸光值。以蒸馏水代替胰蛋白酶溶液，其他加入试剂同上，作为空白调零。　　1.2.6大豆胰蛋白酶抑制剂（SoybeanTrypsinInhibitor，简称SBTI）粗提物的制备将大豆粉碎，溶于蒸馏水中，4℃搅拌过夜。3000r／min离心15min，将沉淀用等量蒸馏水复提、离心，合并两次上清液，4℃保存、备用。　　1.2.6.1等电点沉淀法取部分上清液，缓慢搅拌，同时滴加1.0mol／L的HCl，调节pH至4.4～4.6，立即停止搅拌，静置，蛋白质形成较大颗粒沉淀。离心，以NaOH回调pH至初始液pH，应用BANA法检测上清液（Ⅰ）和沉淀（"）的活性。　　1.2.6.2盐析法［12］另取部分上清液缓慢搅拌，同时加入少量研细的无水CaCl2，逐步使CaCl2的浓度达到0.0375mol／L，蛋白质形成较大颗粒沉淀，离心，得上清液（Ⅱ）和沉淀（$）。将沉淀（$）复溶、离心，得上清（Ⅲ）和沉淀（　　）。重复以上操作，得上清（Ⅳ）和沉淀（（），BANA法检测各部分SBTI活性。　　1.2.7固定化胰蛋白酶壳聚糖树脂对SBTI的吸附实验称取4.0g（湿重）偶联胰蛋白酶的壳聚糖树脂于锥型瓶中，加入3.3％SBTI粗提物的pH7.8硼酸缓冲溶液12mL，25℃恒温水浴，80r／min，吸附12h。　　3000r／min离心15min，吸取1.6mL上清液，加入0.1％的胰蛋白酶水溶液0.6mL，室温反应2min，其余操作同1.2.5。通过BANA法测定胰蛋白酶活性，间接反映固定化胰蛋白酶壳聚糖树脂对SBTI的吸附性能。同时设置阳性对照组1（不加上清液），阴性对照组2（未经吸附的SBTI粗提液）和未活化树脂组3（表1）。　　2结果与讨论2.1交联壳聚糖树脂活化及偶联条件的优化作为一种新型的配基偶联载体，载体与配基的偶联量的大小与偶联条件是否容易控制，是衡量一个亲和吸附剂的重要条件。为优化活化与偶联的条件，在单因素实验结果的基础上，我们对主要影响因素：NaOH的量、环氧氯丙烷的量、活化温度、偶联温度做了四因素三水平的正交设计实验，因素水平安排，正交实验结果表略。　　由正交实验结果可见，对活化与偶联影响的主次因素为：环氧氯丙烷的量＞偶联温度＞活化温度＞NaOH的量，即当环氧氯丙烷为1.6mL，活化温度为80℃，偶联温度为30℃，NaOH浓度为1mol／L时，胰蛋白酶偶联量较大，可达24.65mg／g壳聚糖树脂，偶联率为98.6％，高于文献报道的60.5％的偶联率，但偶联量不高，可能是加入胰蛋白酶量较少，但并不影响我们正交实验结果，**适加酶量可在所有**因素确定后再次优化确定，因此胰蛋白酶的偶联量还应有很大的提高空间。同时考虑到实际操作中设备的耐久性及工业扩大化生产中耗能成本问题，本次实验**终选择活化温度为60℃，以便降低活化过程中的耗能，节约成本，同时可以避免高温对树脂结构的影响，此条件下测定胰蛋白酶偶联量为24.63mg／g壳聚糖树脂。可见，选择活化温度为60℃，相比活化温度为80℃，并不会显著影响胰蛋白酶的偶联量，因此是完全可行的。　　2.2硼氢化钠对树脂活化的影响取1.0g树脂，加入4.0mL1.0mol／L的NaOH溶液，不同量NaBH4，根据优化实验结果进行树脂的活化处理3h，按照1.2.3活化环氧基含量的测定方法，测定pH。　　pH越高，Na2S2O4与环氧基加成反应生成的组别胰蛋白酶水溶液（mL）底物（BANA）缓冲溶液（mL）上清液（mL）H2O（mL）1阳性对照0.61.6－2.62阴性对照0.61.61.03未活化树脂0.61.61.04固定化树脂0.61.61.0羟基越多，即活化效果越好。　　硼氢化钠是一种弱还原剂，其还原活性比较低，一般只能还原醛、酮和亚胺，因此不会影响到树脂上的其他基团。硼氢化钠在水或醇体系中，负离子基团BH4－直接进攻反应底物提供负氢而将底物还原。在活化反应过程中，加入硼氢化钠，可以避免一些亲核电子对环氧基进行亲核攻击，而发生开环反应，因此，对环氧基具有一定的保护作用。采用2.1优化后的实验结果，活化后壳聚糖树脂含有环氧基数量约为141.25μmol／g树脂。当加入硼氢化钠的量为4.0mg时，活化促进作用**为显著，活化生成环氧基数量约为446.68μmol／g树脂，相比不添加硼氢化钠的样品提高2倍之多。由图1可见，当添加硼氢化钠的浓度为4.0～6.0mg时，对壳聚糖树脂活化具有明显的促进作用。　　2.31，4－二氧六环对树脂活化的影响取1.0g树脂，加入4.0mL1.0mol／L的NaOH溶液，不同量的1，4－二氧六环，采用2.1优化后的实验结果，活化3h。同样采用1.2.3方法测定活化环氧基含量。由于环氧氯丙烷在水中的溶解度很小，这就降低了在水相体系中对树脂的活化程度。　　1，4－二氧六环可以与水以任意比例混合，同时也可以溶于有机溶剂中，可充当有机溶剂与水相相互联系的媒介。因此，添加1，4－二氧六环可增加反应体系的极性，增大环氧氯丙烷在水中的溶解度，促进活化过程的进行。　　经实验测定，当加入1，4－二氧六环的量为6.0mL时，促进活化效果**为明显，活化生成环氧基数量约为371.53μmol／g树脂，相比不添加1，4－二氧六环的样品提高1倍。由图1可知，在一定范围内，随着1，4－二氧六环加入量的增加，活化作用不断增强，当加入量为4.0～8.0mL时，活化促进作用较为明显。　　2.4胰蛋白酶酶活力的测定（BANA法）由图2可知，在胰蛋白酶加入量为0～0.6mL之间时，底物过量，随着酶加入量增加，反应速度增大，当0.1％胰蛋白酶加入量为0.6mL时，反应速度达到**。当胰蛋白酶加入量大于0.6mL时，吸光值下降，说明胰蛋白酶已过量，可能过量的酶对反应具有一定的抑制作用。因此，在以后的胰蛋白酶抑制剂活力测定中，为确保胰蛋白酶被底物饱和，达到**反应速度，在底物浓度为0.04％时，0.1％胰蛋白酶用量为0.6mL。　　2.5SBTI粗提物的制备2.5.1等电点沉淀法利用酸将上清液pH调至4.5左右时，大部分蛋白质处于等电点状态而聚集沉淀下来，可达到分离的目的。应用BANA法，检测上清液（Ⅰ）和沉淀（）SBTI活性，结果见表3。上清（Ⅰ）活性明显低于对照（不加SBTI），而沉淀（）活性与对照基本相同，说明SBTI并没有随大豆蛋白聚集而沉淀，而是保留在上清液中。因此，此上清液可作为SBTI粗提物用于以后实验中固定化胰蛋白酶亲和吸附SBTI性能的验证。另外，沉淀的大豆蛋白用0.1mol／LNaOH回调至初始pH后，沉淀复溶性良好，可进一步加工利用。　　2.5.2盐析法加入无机盐CaCl2可增大溶液体系的离子强度，使大豆蛋白中较大极性的物质沉淀。离心后检测上清（Ⅱ）和沉淀（）SBTI活性，结果见表3。　　上清（Ⅱ）活性与对照基本相同，说明上清（Ⅱ）基本没有SBTI存在；而沉淀中可检测到SBTI活性，说明当CaCl2的浓度达到0.0375mol／L时，SBTI在盐析的过程中随着蛋白沉淀，全部转移到蛋白沉淀中。将沉淀用水溶解，搅拌过夜，离心，检测二次水复提后上清（Ⅲ）和沉淀（‘）SBTI活性；重复以上操作，检测三次水复提后上清（Ⅳ）和沉淀（））SBTI活性。可见，反复用水溶解沉降蛋白，离心后上清中具有SBTI活性，并且沉淀中SBTI活性不断减弱，说明经反复复提后，可将SBTI从沉淀中再次提取出来，合并上清液，也可获得大豆蛋白中绝大部分的SBTI。　　2.5.3两种方法的比较比较以上两种方法，等电点沉淀法比盐析法更加简单易行，且大豆蛋白的其他组分可以继续加工利用，使自然资源得以充分开发。因此，本实验采用等电点沉淀法制备SBTI粗提物。　　2.6固定化胰蛋白酶壳聚糖树脂对SBTI的吸附按表1中各处理样，采用BANA法，通过检验胰蛋白酶活性的减少，反映固定化胰蛋白酶的壳聚糖树脂是否具有亲和胰蛋白酶抑制剂活性。　　可知，固定化胰蛋白酶壳聚糖树脂组的胰蛋白酶活性明显高于阴性对照和未经活化树脂组，而低于阳性对照，说明该组树脂可以吸附SBTI，从而使上清液中的SBTI减少，与阴性对照组相比，其对SBTI的清除率约为33.3％，表明本实验制备的壳聚糖树脂成功地偶联上胰蛋白酶，并且具有亲和吸附胰蛋白酶抑制剂活性，因此可作为一种新型的亲和载体材料。进一步的实验优化正在进行之中。　　3小结本实验将一种新型的亲和载体－壳聚糖树脂，应用于胰蛋白酶的固定化研究，采用低成本、低毒、高效的环氧氯丙烷为活化剂，得到了树脂活化和偶联的**条件，探讨了添加硼氢化钠和1，4－二氧六环对壳聚糖树脂的活化促进作用，并证明了胰蛋白酶已成功地偶联到壳聚糖树脂上，且具有亲和吸附胰蛋白酶抑制剂作用，为固定化胰蛋白酶壳聚糖树脂作为亲和载体，简单、快捷地从大豆乳清液中提取纯化胰蛋白酶抑制剂奠定了基础。同时，这种亲和载体材料的应用成本，大大低于目前常用的琼脂糖树脂和葡聚糖树脂，如应用于工业化扩大生产中提取纯化胰蛋白酶抑制剂，可以极大地节省提取纯化过程的成本，有广阔的市场应用前景。　　 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